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時間：2023-01-03作者：山東中安生物安全檢測有限公司瀏覽：59

PCR實驗室是指能在短時間內(nèi)擴(kuò)增出目的基因片段的生物工程技術(shù)，應(yīng)用于病毒檢測、病原體快速鑒定、個體識別、遺傳診斷及基因等領(lǐng)域。

在此次中， PCR實驗室主要應(yīng)用的技術(shù)包括：病毒全基因組擴(kuò)增與測序、核酸雜交技術(shù)與熒光原位雜交技術(shù)等。

下面是關(guān)于 PCR實驗室檢測的相關(guān)內(nèi)容，希望能對您有所幫助。

PCR實驗室檢測可分為：樣本前處理和樣本后處理兩個部分：

本文主要介紹樣本前處理中的 PCR實驗室檢測，如有需要也可查看參考文獻(xiàn)或咨詢相關(guān)專業(yè)人士。

由于試劑盒等不能保證完全覆蓋實驗結(jié)果，我們需要根據(jù)實際情況做一些針對性處理，如：核酸擴(kuò)增的條件是否合適、實驗試劑對實驗結(jié)果影響程度、實驗室人員技術(shù)水平以及實驗室空間等因素都會影響實驗結(jié)果。

一、PCR擴(kuò)增條件

1.水： PCR擴(kuò)增的過程中，由于核酸濃度高，需要大量清水，一般采用無菌水進(jìn)行稀釋到10-50 mg/mL范圍內(nèi)；

2.電泳主要是通過施加電壓讓 DNA聚合酶與模板進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，在一定時間內(nèi)將模板復(fù)制出來；

3.引物的種類、濃度以及長度對 PCR結(jié)果有很大影響；

4.模板： PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果受模板的影響比較大，因此 PCR實驗室應(yīng)建立自己的模板庫。

5. Taq酶：如果實驗用 Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，需根據(jù) DNA反應(yīng)體系選擇適當(dāng)?shù)?Taq酶；

6.擴(kuò)增產(chǎn)物的分析： PCR實驗室擴(kuò)增產(chǎn)物可通過質(zhì)譜檢測（LC-MS/MS）。

二、試劑的選擇

實驗中常用的試劑有： DNA凝膠電泳試劑（如： PAGE、SDS-PAGE、 SV或SPE-PCR等）和熒光定量 PCR試劑（如 MassA等）。

DNA凝膠電泳和熒光定量 PCR所用探針的選擇與其擴(kuò)增效率相關(guān)，一般需根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x擇探針。

如果實驗需要比較高濃度的引物，應(yīng)選擇非特探針（如： MassA）；如果實驗是需要檢測低濃度（例如1μg/μl、5μg/μl）的目標(biāo)，則可選擇特探針。

熒光定量 PCR的常用探針有：引物和探針類型是影響檢測結(jié)果的重要因素之一。

不同的檢測方法對于每個步驟都有特殊要求，選擇適當(dāng)類型的引物和正確使用適宜濃度的探針對提高檢測結(jié)果是至關(guān)重要的。

由于不同種類引物可能造成相同區(qū)域重復(fù)擴(kuò)增，因此應(yīng)盡可能用相同引物和相應(yīng)區(qū)域引物；在相同 PCR反應(yīng)條件下，選擇較合適、較穩(wěn)定且易于保存和使用的引物會得到擴(kuò)增效果；在相同 PCR條件下，也可以選擇較穩(wěn)定且容易獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物-金標(biāo)準(zhǔn)探針，但應(yīng)注意該引物并不能保證一定在擴(kuò)增反應(yīng)中得到結(jié)果。

三、檢測試劑盒對實驗結(jié)果的影響程度

首先要明確檢測試劑盒對實驗結(jié)果的影響，一般情況下：

如果實驗需要，則需要先用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

在實驗過程中，由于使用的試劑較多，可能會出現(xiàn)假陰性情況（即未擴(kuò)增出核酸）。

由于 PCR檢測的靈敏度和特都很高，對于假陽性結(jié)果應(yīng)立即做其他檢查。如果是特殊情況，如：臨床樣本檢測不到核酸時，可以先使用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

最后一個問題：實驗室空間的問題。

四、檢測樣品的保存條件

PCR擴(kuò)增所需的較適溫度為37℃，在低溫下，擴(kuò)增效率會明顯降低。

此外還需要注意的是：溫度越高，擴(kuò)增效率越低。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)需要2-4℃或4-8℃的相對低溫環(huán)境中進(jìn)行，所以 PCR檢測室要保證環(huán)境溫度在15-30℃。

由于實驗所用液體一般都是有一定粘度和流動性的樣品，為了避免核酸變性、減少樣品變性、降低試劑成本等原因，需要對核酸進(jìn)行保護(hù)（加入 DMSO）以及對核酸進(jìn)行預(yù)變性以減少變性后引起的假陽性結(jié)果。

1、 DMSO是將反應(yīng)體系中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%濃度的 DMSO作為保護(hù)劑，其可防止 DNA及 RNA在反應(yīng)中變性和降解；

2、預(yù)變性是指將反應(yīng)體系中的樣品進(jìn)行適當(dāng)緩沖溶液處理以防止樣品變性，從而提高 PCR擴(kuò)增效率。預(yù)變性步驟一般可在2-8℃進(jìn)行。

五、試劑、樣本前處理與后處理

常用的試劑包括：

DNA/RNA （通用試劑）：常用的 DNA擴(kuò)增試劑，例如 Taq酶酶切探針、 dNTP裂解探針等。

酶：酶法 PCR的擴(kuò)增效率取決于所用的酶種類及濃度，因此在擴(kuò)增過程中可能需要更換不同的酶。

其他試劑：常規(guī) PCR使用的核酸提取、檢測所需引物，引物及探針等均需要進(jìn)行制備與優(yōu)化； PCR所需核酸片段（探針），如 DNA片段、DNA-RNA等也需要進(jìn)行后處理，以保證在 PCR擴(kuò)增過程中能夠達(dá)到要求。

常見實驗樣品有血細(xì)胞（血小板等）、腦脊液（細(xì)胞和組織）、血清（白蛋白等）及各種生物組織（肌肉和結(jié)締組織等）。

常見實驗項目有血清分析：血清蛋白定量檢測、抗體定量檢測和全血分析；細(xì)胞分析：組織活檢和細(xì)胞學(xué)檢驗；生物樣本：基因芯片研究與分析。

六、核酸提取方法與步驟（包括但不限于提取 DNA等）

提取核酸需要先將基因組 DNA溶解，然后再進(jìn)行下一步處理。

目前常用的方法有以下幾種：

1、核酸酶法：利用特酶切反應(yīng)，將核酸直接從 DNA模板上切割下來，得到目標(biāo)產(chǎn)物。常見的有 Taq酶、 DNA聚合酶、 RNase。

2、核酸雜交法：利用特雜交反應(yīng)，將目的基因轉(zhuǎn)化到靶基因的表達(dá)上去；

3、原位雜交法：利用組織、細(xì)胞或其他微生物的 DNA作為探針，在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位檢測；

4、毛細(xì)管電泳法：利用毛細(xì)管電泳和核酸擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，對靶組織和細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

以上都是針對傳統(tǒng)方法存在的問題， PCR實驗室檢測可以根據(jù)實際情況使用相應(yīng)的方法，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

七、檢測儀器與設(shè)備

PCR檢測儀器與設(shè)備主要有以下幾種：

全自動恒溫擴(kuò)增儀：

實時熒光定量 PCR儀：

熒光分光光度計：

電子擴(kuò)增儀或毛細(xì)管電泳式自動進(jìn)樣器，具有擴(kuò)增效率高、反應(yīng)時間短和檢測范圍廣等優(yōu)點。

液相色譜儀：

液相色譜是一種專門用于分離提純和質(zhì)量控制的小型分析儀器，具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。


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