百螢課堂之APC與抗體的綴合實(shí)驗(yàn)方案

時(shí)間：2024-06-21作者：西安百螢生物科技有限公司瀏覽：7

注1:整個(gè)綴合過(guò)程可以在 內(nèi)完成。但是，綴合前對(duì)APC 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面

列出的材料外，您還需要濃度至少為2mg/ml的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行APC抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉

如何使用脫鹽柱以及如何吸光度光譜。

注 2 : SMCC-APC綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液”中，在4℃下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此，  如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間，可以選擇同時(shí)綴合10毫克或多的 APC,并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(在幾周內(nèi))。

 

一 .APC的制備

1. 將APC純化。綴合前的濃度通常為 5-10mg/ml。 

注意：APC在綴合前作為SAS(銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將APC 以SAS沉淀物的形式儲(chǔ)存，則在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫升1升的“透析緩沖液”透析之前，用每毫升1升APC 的PBS進(jìn)行透析2 次。

2.使用1.7毫克APC 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過(guò)程中損失的額外10%。

3.檢查APC的純度和濃度，請(qǐng)測(cè)量280、620和655nm 處的吸光度。(1 mg/ml的APC  在 655nm處的OD為 5.9 ) 。 655/620比率>1.4 表明雜質(zhì)被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除。

二.APC的活化

1.使用前在無(wú)水DMSO中制備10mg/ml的SMCC 儲(chǔ)備溶液。

2.每毫克APC加入6μlSMCC,并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。

3.將純化的 APC  過(guò)凝膠過(guò)濾柱來(lái)交換緩沖液。

注意：對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少SMCC 相對(duì)于APC 的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

 

三.1gG 還原

1.在蒸餾水中制備1M DTT(15.4 mg/100 μl)  的新鮮溶液。

2.1gG溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml或高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行；MES 、磷酸鹽和 TRIS 緩沖液(pH 范圍為6至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度2mg/ml，則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升 IgG溶液加入20μlDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，額外攪拌 (以盡量減少半胱酸再氧化為胱酸)。

4.將還原的lgG 通過(guò)預(yù)平衡的“交換緩沖液”過(guò)濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測(cè)定蛋白濃度，并將含

有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起?？梢酝ㄟ^(guò)分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意：對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況，降低 DTT  濃度可能會(huì)有所幫助。

 








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