海藻糖對枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化研究

時間：2024-11-14作者：威尼德生物科技(北京)有限公司瀏覽：263

一、引言

 

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種革蘭氏陽性菌，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。它具有非致病性、分泌蛋白能力強、遺傳背景清晰等優(yōu)點，是生產(chǎn)酶、抗生素和其他生物活性物質(zhì)的重要宿主菌。然而，其電轉(zhuǎn)化效率較低一直是限制其基因工程操作的關(guān)鍵因素之一。

 

電轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 導入細菌細胞的一種重要方法。在電轉(zhuǎn)化過程中，細胞膜在高壓電場作用下形成臨時性的孔道，使外源 DNA 能夠進入細胞。但這個過程對細胞造成的損傷往往較大，影響細胞的存活率和轉(zhuǎn)化效率。海藻糖是一種**的非還原性二糖，已被證明在多種生物體系中具有保護細胞免受各種脅迫的作用，如干旱、高溫和冷凍等。在微生物電轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，海藻糖可能通過穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)、減少細胞內(nèi)冰晶形成等機制來提高細胞在電轉(zhuǎn)化過程中的存活率和轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究旨在探索海藻糖對枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，以期為枯草芽孢桿菌的基因工程改造提供較有效的手段。

 

二、材料與方法

 

（一）菌株和質(zhì)粒

 

枯草芽孢桿菌菌株 [具體菌株編號] 為本實驗室保存。表達載體質(zhì)粒 [質(zhì)粒名稱]，攜帶 [具體抗性基因和目的基因等相關(guān)信息]。

 

（二）培養(yǎng)基和試劑

 

1. 培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，其配方為：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。固體培養(yǎng)基添加 1.5% 的瓊脂粉。

2. 試劑
高純度海藻糖（分析純），電轉(zhuǎn)緩沖液（[具體配方成分和濃度]），其他常規(guī)化學試劑如氯化鈣、乙醇等均為分析純。

 

（三）細胞培養(yǎng)與預處理

 

從 - 80℃甘油保存的枯草芽孢桿菌甘油菌中挑取單菌落接種于 5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。

取 1ml 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至 100ml 新鮮 LB 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD???達到 0.6 - 0.8。

將培養(yǎng)好的菌液在冰上放置 10 分鐘，然后 4℃、5000rpm 離心 10 分鐘收集菌體。

用預冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌菌體兩次，最后將菌體重懸于適量體積的電轉(zhuǎn)緩沖液中，使細胞濃度達到 [具體濃度值]。

 

（四）海藻糖處理

 

在重懸后的細胞懸液中分別加入不同終濃度的海藻糖（0、50mM、100mM、150mM、200mM），充分混勻后在冰上孵育 30 分鐘。

 

（五）電轉(zhuǎn)化操作

 

將處理好的細胞與 1μg 純化的質(zhì)粒 DNA 混合，轉(zhuǎn)移至預冷的電轉(zhuǎn)化杯中（電極間距為 0.2cm）。

使用電轉(zhuǎn)化儀（[電轉(zhuǎn)化儀型號]）進行電轉(zhuǎn)化，設(shè)置不同的電壓（1000V、1250V、1500V、1750V、2000V）和電容（25μF），脈沖時間固定為 5ms。

電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即加入 1ml 預冷的復蘇培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基添加 0.5M 山梨醇），轉(zhuǎn)移至 1.5ml 離心管中，37℃、100rpm 振蕩復蘇 2 小時。

 

（六）轉(zhuǎn)化子篩選與計數(shù)

 

取適量復蘇后的菌液涂布于含有相應抗生素（根據(jù)質(zhì)粒攜帶抗性基因選擇）的 LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，計算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化子數(shù) /μg DNA）。同時，通過平板計數(shù)法測定未加質(zhì)粒 DNA 的細胞在電轉(zhuǎn)化后的存活率，以評估海藻糖對細胞在電轉(zhuǎn)化過程中損傷的保護作用。

 

三、結(jié)果

 

（一）海藻糖濃度對細胞存活率的影響

 

在不同電壓下，未添加海藻糖的細胞在電轉(zhuǎn)化后的存活率較低。隨著海藻糖濃度的增加，細胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在 100 - 150mM 海藻糖濃度范圍內(nèi)，細胞存活率在各電壓下均達到較高水平。例如，在 150mM 海藻糖和 1500V 電壓條件下，細胞存活率比未添加海藻糖時提高了約 [X]%。

 

（二）海藻糖濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

 

不同電壓下，海藻糖濃度對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。在較低電壓（1000 - 1250V）下，低濃度（50mM）海藻糖對轉(zhuǎn)化效率有一定的提高作用，但效果不明顯。隨著電壓升高，100 - 150mM 海藻糖濃度可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。在 1500V 和 150mM 海藻糖條件下，轉(zhuǎn)化效率比未添加海藻糖時提高了約 [Y] 倍。

當海藻糖濃度過高（200mM）時，轉(zhuǎn)化效率反而下降，可能是由于高濃度海藻糖對細胞生理狀態(tài)產(chǎn)生了負面影響，如滲透壓改變等。

 

（三）電壓對轉(zhuǎn)化效率的影響

 

在相同海藻糖濃度下，電壓對轉(zhuǎn)化效率也有重要影響。較低電壓下，細胞膜形成的孔道不足以使足夠量的 DNA 進入細胞，導致轉(zhuǎn)化效率較低。隨著電壓升高，轉(zhuǎn)化效率增加，但過高的電壓（2000V）會導致細胞大量死亡，使轉(zhuǎn)化效率下降。在 150mM 海藻糖存在下，1500 - 1750V 電壓范圍內(nèi)可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

 

四、討論

 

（一）海藻糖提高細胞存活率的機制

 

海藻糖可能通過多種機制提高枯草芽孢桿菌在電轉(zhuǎn)化過程中的存活率。一方面，海藻糖可以與細胞膜磷脂雙分子層相互作用，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)，減少高壓電場對細胞膜的破壞。在電轉(zhuǎn)化過程中，細胞膜受到高強度電場的作用，磷脂雙分子層的排列容易紊亂，海藻糖的存在可以在一定程度上維持細胞膜的完整性。另一方面，海藻糖可能作為一種細胞內(nèi)的保護劑，減少細胞內(nèi)水分在電脈沖過程中的重排和冰晶形成，從而降低對細胞內(nèi)細胞器和生物大分子的損傷。

 

（二）海藻糖提高轉(zhuǎn)化效率的原因

 

由于海藻糖提高了細胞存活率，使得更多的細胞在電轉(zhuǎn)化后能夠存活并進行后續(xù)的基因表達和復制過程，從而增加了轉(zhuǎn)化子的數(shù)量。存活的細胞有更多的機會攝取和整合外源 DNA，進而提高轉(zhuǎn)化效率。

 

海藻糖可能影響細胞膜在電脈沖后的恢復過程，使得細胞膜孔道在合適的時間內(nèi)保持開放狀態(tài)，有利于外源 DNA 的進入。同時，海藻糖可能與 DNA 分子有一定的相互作用，促進 DNA 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定存在和整合，進一步提高轉(zhuǎn)化效率。

 

（三）較佳條件的選擇

 

綜合考慮細胞存活率和轉(zhuǎn)化效率，150mM 海藻糖和 1500 - 1750V 電壓是本研究中枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化的較優(yōu)條件。在這個條件下，能夠在保證較高細胞存活率的同時獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。這個優(yōu)化后的方法為枯草芽孢桿菌的基因工程操作提供了較有效的途徑，例如在構(gòu)建基因文庫、表達外源蛋白等方面具有重要應用**。

 

五、結(jié)論

 

本研究通過系統(tǒng)地研究海藻糖濃度和電轉(zhuǎn)化電壓對枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化的影響，成功優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化方法。合適濃度的海藻糖能夠顯著提高細胞在電轉(zhuǎn)化過程中的存活率和轉(zhuǎn)化效率，較佳條件為 150mM 海藻糖和 1500 - 1750V 電壓。這種優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法將有助于推動枯草芽孢桿菌在生物技術(shù)領(lǐng)域的進一步應用，為后續(xù)的基因工程研究和工業(yè)生產(chǎn)提供有力支持。同時，本研究也為其他微生物電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化提供了一定的參考，尤其是對于那些對電轉(zhuǎn)化敏感、轉(zhuǎn)化效率低的微生物，探索類似的保護劑和優(yōu)化條件可能具有重要意義。

 

在未來的研究中，可以進一步深入研究海藻糖與枯草芽孢桿菌細胞內(nèi)其他成分在電轉(zhuǎn)化過程中的相互作用機制，以及探索其他可能的添加劑或處理方法來進一步提高電轉(zhuǎn)化效率。此外，將優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法應用于較復雜的基因工程操作，如多基因表達系統(tǒng)的構(gòu)建等，也是值得探索的方向。


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