PIPES緩沖液制備高效率感受態(tài)方法

時(shí)間：2022-01-10作者：湖北新德晟材料科技有限公司瀏覽：6

哌嗪二乙磺酸PIPES有多種緩沖液體系，其中緩沖溶液Transformation Buffer（也叫TB溶液）可用于制備高效率感受態(tài)的細(xì)胞。

感受態(tài)是指細(xì)胞（或細(xì)菌）能夠從周圍環(huán)境中攝取DNA分子，并且不易被細(xì)胞內(nèi)的限制性核酸內(nèi)切酶分解時(shí)所處的一種特殊生理狀態(tài)。有些細(xì)菌是自然感受態(tài)，如枯草芽孢桿菌，有些是人工感受態(tài)，如大腸桿菌。經(jīng)過特殊方法處理受體細(xì)胞，可改變細(xì)胞膜通透性，使其成為容許有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。

Transformation Buffer制備：

配制哌嗪二乙磺酸PIPES 3.0g 10mM、CaCl2·2H2O 2.2g 15mM、KCl 18.6g 250mM，加水 950ml，用5N KOH 調(diào)PH至6.7-6.8*低PH不溶，再加終濃度為55mM的MnCl2·4H2O 10.9g定溶到1升，過濾滅菌，4度保存。

感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化采用氯化鈣的方法。液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌，在LB平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。挑直徑1-3mm 的菌落接種到250ml/3L錐形瓶或80ml/1L 錐形瓶的SOB培養(yǎng)基。在18度150-250RPM 培養(yǎng)19-50h。當(dāng)OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng)，放在4度冰水中冷卻10min，300RPM離心15min，回收菌體去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10min再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮，添加較終濃度為7%的DMSO，再冷卻10分鐘0.1-1ml 分裝，直接在液氮或-80度保存。

懸浮大腸桿菌的TB溶液中，主要其作用成分包括緩沖液PIPES和使細(xì)胞轉(zhuǎn)化成感受態(tài)的氯化鈣。需要注意的是，該方法適用不含有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，而不適合大質(zhì)粒，凍存后轉(zhuǎn)化效率有降低的可能。另外，不同細(xì)菌菌株的較適宜OD600也是是不同的，需要根據(jù)不同試驗(yàn)調(diào)整。

用TB制備感受態(tài)細(xì)胞的方法還有很多，不同的方法效率高低可能有差異，適用的菌種或細(xì)胞類型也可能不同。德晟生產(chǎn)的PIPES為粉末試劑，可根據(jù)不同的需求自行配制感受態(tài)TB溶液。


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