科研小技巧：如何QC RNA

時(shí)間：2020-01-05作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：1330

	作者：Suzanne  來源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】


	
		如何提取組織、細(xì)胞RNA至今仍是一個(gè)熱門話題?？茖W(xué)界許多新發(fā)現(xiàn)有賴于半衰期僅有5秒的低拷貝mRNA。
	
	
		言歸正傳，我們**講了已經(jīng)很多基本知識(shí)。如，加入變性緩沖液后快速劇烈透徹的均質(zhì)化是抑制核酸酶和較大程度釋放RNA的關(guān)鍵。還有，我們也說過不同類型樣品的均質(zhì)化方法，從最后說到使用大型珠磨研磨設(shè)備可以用哪些研磨珠。選用哪種方法要看手上有什么設(shè)備，以及一天內(nèi)要處理多少個(gè)樣品。珠磨研磨法可一次性處理多個(gè)樣品，樣品獲得同等的裂解效率，保證均一性。樣品比較少的話，研缽加研杵或者手持電動(dòng)均質(zhì)器這類一次只能處理一個(gè)樣品的方法比較合適。但是每做完一個(gè)樣品都要清洗設(shè)備，就會(huì)大大增加交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
	
	
		我們尚未討論過的一個(gè)話題是如何定量定性檢測(cè)RNA。準(zhǔn)確分析RNA是保證下一步實(shí)驗(yàn)獲得可重復(fù)性結(jié)果的關(guān)鍵。結(jié)果要從一開始就要保持一致。
	
	
		檢測(cè)RNA得率：
	
	
		有幾種方法可以用來給RNA做定量。較常用也較便宜的莫過于Nanodrop分光光度計(jì)等紫外光吸光度的儀器。Nanodrop還有一個(gè)好處就是能提供RNA純度信息。你可以獲知代表樣品中蛋白雜質(zhì)含量的260/280比值，還可以通過260/230比值知道樣品中是否還有其它雜質(zhì)（如胍酸鹽）。RNA的較佳260/280比值范圍是1.8-2.1，260/230比值較好是大于1.5。下圖是Nanodrop所能提供信息的圖標(biāo)。
	
 
	
		需要注意的是，若RNA濃度**特定濃度（20ng/μl），Nanodrop檢測(cè)數(shù)據(jù)將不再準(zhǔn)確。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)260濃度不能與280或230平衡的時(shí)候，比值數(shù)據(jù)就會(huì)出現(xiàn)異常。在這種情況下，留意Nanodrop的波形圖。確保所看到的峰值不是220-230或280。只有曲線中峰值在260，RNA才是安全的。
	
	
		為了較好地說明問題，拿一個(gè)土壤RNA實(shí)驗(yàn)的圖舉例。你可以看到有兩條曲線在230處出現(xiàn)峰值，然后像滑雪斜坡一樣走下來。情況不妙。230處的峰值表示有鹽污染，鹽來源于氰酸胍之類用來裂解細(xì)胞核抑制RNase的組分。若未完全沖洗干凈，會(huì)影響整個(gè)曲線圖，260讀數(shù)虛高。
	
 
	
		黃色和綠色曲線是同時(shí)含有的大量鹽、腐植酸抑制因子污染的樣品。腐植酸從230處大量吸光，貫穿整條曲線至320。上四個(gè)樣品RNA剛提出來的時(shí)候都是棕色的。
	
	
		正常的圖形應(yīng)該是綠色和黃色下面的曲線。在圖上往230靠近是一個(gè)很漂亮的下坡，260處有峰值，然后280處再次走下坡。然后，看較底下的紅色和黑色曲線，它們是純凈但濃度很低的RNA。230和280讀數(shù)都很低，與260比值不等于2:1。這并不意味著RNA質(zhì)量不好，從圖上并未看到滑雪斜坡或者曲線走直線，RNA還是可以用的。
	
	
		低濃度RNA我們還有較靈敏的檢測(cè)方法。我們有時(shí)候會(huì)用Ribogreen Kit和Qubit機(jī)器。Ribogreen染色法的好處是它只檢測(cè)RNA。在使用較其方便的同時(shí)，它只并不能提供RNA完整性和純度方面的信息。在**的文章里，我們已經(jīng)拿質(zhì)粒樣品對(duì)比討論過了紫外分光光度法和熒光燃料法定量檢測(cè)DNA的異同。要獲得比較數(shù)據(jù)，請(qǐng)點(diǎn)擊上述鏈接查看相關(guān)文章。
	
	
		檢測(cè)完整性：
	
	
		除了RNA的得率，評(píng)價(jià)RNA提取的好壞還得看完整性。完整性意味著RNA的完整或未被降解程度。通常我們會(huì)看電泳條帶中rRNA的濃度。真核細(xì)胞的28S的濃度應(yīng)該是18S的兩倍，細(xì)菌要看的23S和16S rRNA條帶。只需簡(jiǎn)單地跑一個(gè)5-10μl 樣品標(biāo)準(zhǔn)1% DNA瓊脂糖凝膠就可以。只是快速檢測(cè)RNA完整性，沒必要跑變性凝膠。下面是PowerLyzer UltraClean Tissue and Cells RNA Kit提取到的老鼠肝臟RNA電泳圖。
	
 
	
		肝臟RNA含量非常高，所以只加了5μl跑膠。若RNA點(diǎn)樣太多，反而不容易把條帶跑開。
	
	
		高質(zhì)量的RNA，上層28S條帶應(yīng)該比下面的18S條帶要濃2倍，而且條帶略彎和非常清晰。樣品均質(zhì)化步驟做得好的話，上面的DNA在凝膠上將不會(huì)有。若28S條帶跟18S的濃度差不多，表示樣品稍微有些降解。28S與18S的模糊段是mRNA。而其它段的彌散帶不是個(gè)好現(xiàn)象。
	
	
		還有安捷倫的Bioanalyzer可以分析RNA的完整性。這款機(jī)器非常好用，只需要1~2μlRNA樣品，通過給出RIN數(shù)字告知rRNA條帶的大小。借此RNA Intergrity Number（RIN）數(shù)值可以直觀地比較不同樣品提取的RNA。
	
	
		這里是安捷倫Bioanalyzer分析的一份結(jié)果。該肝臟RNA樣品在分析前需要用了Eukaryotic Total RNA Nano Series II kit處理。RIN值表明了用珠磨研磨法的MOBIO UltraClean Tissue and Cells RNA Kit 提取的RNA與同樣適用硅膠離心柱的另一競(jìng)爭(zhēng)品牌試劑盒的區(qū)別。
	
	
		Bioanalyzer圖譜的X軸從左往右，數(shù)字越大表示片段越大。45-50之間的片段是28S rRNA，41-42的是18S。如RNA出現(xiàn)了降解，圖上會(huì)在35-40甚至較靠前的位置出現(xiàn)亮點(diǎn)或峰值。RNA片段越大，峰值越靠右。若RNA中有基因組DNA污染，它會(huì)在右邊出現(xiàn)峰值。
	
	
		關(guān)于Nanodrop 和 Agilent Bioanalyzer的更多細(xì)節(jié)，已由Biomedical Genomics整理并發(fā)布在這里。
	
	
		并不是每個(gè)人都能在實(shí)驗(yàn)室里開動(dòng)Agilent Bioanalyzer的。機(jī)器本身就非常昂貴，還有用來分析RNA用的試劑盒也不便宜。如果附近有中心實(shí)驗(yàn)室，也許可以借來用一下，不過肯定需要支付試劑盒的費(fèi)用。
	
	
		所以，這就是為什么這是個(gè)"選擇"。跑個(gè)電泳和分光光度法測(cè)一下RNA的質(zhì)量和得率有多高較實(shí)際。
	
	
		DNA污染：
	
	
		尤其是研究微生物基因的，因?yàn)橐餂]法設(shè)計(jì)成跨外顯子接頭，RNA中的DNA污染就會(huì)很令人頭痛。On-Spin Column DNase removal systems在RNA洗脫前能高效地去除DNA。讓DNase滲入到濾膜中，在RNA洗脫前消化并去除DNA。但通常處理時(shí)間比較長(zhǎng)。如果樣品或者細(xì)胞是儲(chǔ)存在RNALater或RNAProtect Bacteria Reagent里頭的話，DNA就較加不容易被DNase消化。這種情況下，較適合用DNase溶液處理。DNase可以與DNA充分接觸，而不用隔著濾膜奮力尋找DNA。但有個(gè)不好的地方是，在PCR前必須用EDTA或加熱法滅活。為了解決這個(gè)問題，我們開發(fā)出了RTS DNase Kit，一款室溫也能穩(wěn)定保存的高效DNase。可以用特別的DNase吸附樹脂輕易出去。對(duì)寶貴的RNA較其溫和，DNase的去除也較其高效。
	
	
		
	


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