科研小技巧：分光光度法與熒光染色法在定量檢測(cè)DNA應(yīng)用中的區(qū)別

時(shí)間：2014-12-19作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：203

	作者：Suzanne  來源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】


	
		今天我準(zhǔn)備討論一種可能在你整個(gè)科研生涯中一直**的常規(guī)方法。它是如此的基本、簡(jiǎn)單，你可能根本沒在意。但我希望你在睡覺前能稍微想它一下。我要說的是什么？當(dāng)然是質(zhì)粒提取。
	
	
		質(zhì)粒DNA提取作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)，你肯定很希望就算提取過程出錯(cuò)了，依然能回收到DNA。但是，你回收到的真的僅僅是DNA嗎？事實(shí)上質(zhì)粒提取是對(duì)兩種定量檢測(cè)DNA方法較有效的驗(yàn)證：分光光度法 VS. 熒光染色法（Picogreen）。
	
	
		像大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室一樣，我們也用分光光度法定量檢測(cè)核酸。分光光度法簡(jiǎn)單、靈敏，*標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，當(dāng)我們用分光光度法和Picogreen法定量檢測(cè)我們的質(zhì)粒提取試劑盒與其它品牌質(zhì)粒提取的質(zhì)粒時(shí)，結(jié)果令人吃驚。再深入探討前，我們需要了解…
	
	
		質(zhì)粒DNA提取作為現(xiàn)在較常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，你可能希望就算提取過程中盡管犯了點(diǎn)小錯(cuò)，DNA還是能要回來。但是，你要回來的真的只有DNA嗎？碰巧的是，質(zhì)粒提取是區(qū)分兩種DNA定量檢測(cè)方法之間區(qū)別的較好范例：分光光度法 VS. 熒光染色法（Picogreen）。
	
	
		在我們實(shí)驗(yàn)室，我們也用分光光度法定量檢測(cè)核酸。它簡(jiǎn)單、靈敏且不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，當(dāng)我們用分光光度法和Picogreen法比較提取的質(zhì)粒的定量檢測(cè)結(jié)果時(shí)，對(duì)于我們的質(zhì)粒提取試劑盒和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的盒子，結(jié)果非常驚訝。在我們做進(jìn)一步分析前先了解一下Picogreen。
	
	
		什么是Picogreen？
	
	
		Picogreen是一種熒光染料，與雙鏈DNA特異結(jié)合后，能在485/530nm波段發(fā)出熒光?？捎脽晒夥治鰞x或Qubit定量檢測(cè)樣品中的DNA含量。常用的分光光度法檢測(cè)260nm（A260）處的吸光值，缺點(diǎn)是光不能區(qū)分DNA和RNA、鹽、染色劑等雜質(zhì) 是獲知含RNA的DNA樣品準(zhǔn)確濃度的非常有用的工具。
	
	
		跟質(zhì)粒制備有什么關(guān)系？
	
	
		還記得你加入到Tris重懸浮液的RNase嗎？它是用于消化為制備質(zhì)粒而培養(yǎng)的健康的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌中大量存在的RNA。然后，理想情況下，消化了的RNA從硅膠離心柱上洗掉，你只獲得高純度DNA。
	
	
		讓我們吃驚的是質(zhì)粒DNA中有大量RNA污染。見下面的例子。使用瓊脂糖凝膠電泳，電泳中清晰看到RNA雜質(zhì)的模糊條帶。
	
 
	
		*競(jìng)爭(zhēng)品牌試劑盒需要需要在提取前往重懸緩沖液加入RNase A，MOBIO的試劑盒不需要
	
	
		但是，分光光度計(jì)中RNA雜質(zhì)并不能像picrogreen那樣清楚顯示。
	
 
	
		如果你只用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA，以及競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的試劑盒，你肯定會(huì)覺得**的試劑盒較好。凝膠上顯示他們得率是差不多的，但是分光光度計(jì)讀數(shù)讓你認(rèn)為有雙倍的DNA。
	
	
		但是，picogreen卻給出了不一樣的結(jié)果。當(dāng)有RNA存在的時(shí)候，原來2-3倍的假得率顯現(xiàn)了真實(shí)得率。使用MOBIO試劑盒，分光光度法得到的結(jié)果較接近實(shí)際得率。
	
	
		有何意義？
	
	
		這意味著當(dāng)你酶消化樣品準(zhǔn)備做克隆或寄送質(zhì)粒用于測(cè)序前，你能準(zhǔn)確地知道實(shí)際上有多少DNA。在對(duì)克隆結(jié)果排疑或者準(zhǔn)確計(jì)算質(zhì)粒插入率都有很大幫助。
	
	
		我知道并不是每個(gè)人都能用Picogreen檢測(cè)他們的DNA。而且并不都一定要知道準(zhǔn)確的DNA量。我們也不常用這個(gè)方法，說實(shí)在的。只是請(qǐng)注意，當(dāng)你看到質(zhì)粒DNA凝膠底部有個(gè)模糊的條帶，你的質(zhì)粒得率可能只有測(cè)量值的一半，做好相應(yīng)的計(jì)劃準(zhǔn)備即可?；蛘咴囉肕OBIO的Plasmid DNA kit，你就是再也不用擔(dān)心了。
	
	
		我們也知道同樣的問題也會(huì)存在于基因組DNA的制備。我們的的建議是什么？至少用兩種方法檢驗(yàn)DNA質(zhì)量：瓊脂凝膠和分光光度法或picogreen。事實(shí)上只用一種辦法很難給你足夠信息確保下游實(shí)驗(yàn)?zāi)苁欠癯晒M(jìn)行。
	


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